主要用途
HEPENGBIO細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白3 （SIRT3）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)熒光探針氨甲基香豆素標(biāo)記人工合成的乙?；痯53多肽底物，經(jīng)過(guò)SIRT3脫乙?；螅晃稽c(diǎn)特異性氨基肽酶水解，釋放釋放出具有強(qiáng)烈熒光的7-氨-4甲基香豆素，即采用熒光法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的方法。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、線粒體蛋白樣品、部分或完全純化酶樣品中SIRT3的活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
人體組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類(lèi)共20多個(gè)蛋白：種類(lèi)I（class I）與酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細(xì)胞核中；種類(lèi)II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里；上述兩大種類(lèi)的蛋白分子催化結(jié)構(gòu)域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類(lèi)III（class III）為NAD+輔助因子必需，又稱(chēng)為sirtuins，與酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，是進(jìn)化保留的古老的酶類(lèi)，存在于真核生物、古生菌（Archaea）和真細(xì)菌（Eubacteria）等，包括SIRT1至7等，為曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型賴(lài)氨酸脫乙?；福╨ysyl-deacetylase）。催化賴(lài)氨酸脫乙酰基反應(yīng)，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基團(tuán)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的煙酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。其中可溶性SIRT3位于細(xì)胞線粒體內(nèi)，體內(nèi)熱量限制（caloric restriction）、寒冷刺激、細(xì)胞應(yīng)激等因素，使成熟且活性Sirt3由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到線粒體，經(jīng)基質(zhì)加工肽酶（matrix-processing peptidase）激活，表達(dá)增加，作用于乙酰輔酶A合酶2（acetyl CoA synthetase 2）、UCP1、PGC-1α等天然目標(biāo)底物，脫乙?；图せ睢Ｆ涔δ茉谟谡{(diào)節(jié)適應(yīng)性生熱反應(yīng)（thermogenesis）、確保能量產(chǎn)生、提供乙酸的代謝使用、調(diào)節(jié)基礎(chǔ)ATP水平、調(diào)節(jié)影響線粒體通透性的凋亡信號(hào)、調(diào)節(jié)表觀遺傳基因沉默，是代謝或氧化狀態(tài)的感應(yīng)因子，生命延長(zhǎng)（life extension）的標(biāo)志。Sirt3異常，將導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、癌癥、衰老、代謝功能異常等疾病。基于人工合成的乙?；痯53多肽底物Ac- Gln-Pro -Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切離的功能，首先使用熒光染料氨甲基香豆素（aminomethylcoumarin；AMC）來(lái)標(biāo)記乙?；痯53多肽底物，其次進(jìn)行脫乙?；?，最后底物進(jìn)一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強(qiáng)烈熒光的7-氨-4甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin；AMC）（激發(fā)波長(zhǎng)350-360nm；散發(fā)波長(zhǎng)450-465nm），由此來(lái)定量測(cè)定沉默調(diào)節(jié)蛋白3的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
Sirt3
Ac-Gln-Pro-Lys-Lys（Ac）-AMC +  NAD → Ac- Gln-Pro -Lys-Lys-AMC  + nicotinamide  +  O-acetyl-ADP-ribose 
氨基肽酶
Ac-Arg-His-Lys-Lys-AMC      →      Ac-Arg—His-Lys-Lys  +  AMC
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