非蛋白質(zhì)巰基含量檢測(cè)試劑盒說明書-可見分光光度法
非蛋白質(zhì)巰基含量檢測(cè)試劑盒說明書 可見分光光度法
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
提取液二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 5mL 無水甲醇充分溶解備用。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 支，10mg半胱氨酸，4℃保存。臨用前加入 1.65mL 提取液溶解為 50μmol/ml 的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
提取液的配制：將提取液一和提取液二按體積比 1：1 的比例混合配制，按照樣本數(shù)量配制并在當(dāng)天用完。
產(chǎn)品說明：
生物體內(nèi)巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內(nèi)具有重要的解毒功能， 對(duì)生物體的自我調(diào)節(jié)具有非常重要的生理意義。
巰基基團(tuán)與 5,5’- 二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在 412nm 處有最大吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品：
可見分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、1mL 玻璃比色皿、甲醇、研缽/勻漿器和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣品的制備
1、 動(dòng)物、植物組織：稱取約 0.1g，加入 1mL 的提取液，制備成 10%的勻漿，10000g，常溫離心
10min，取上清待測(cè)。
2、 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）然后 10000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。
3、 血清（漿），培養(yǎng)液：向 0.1mL 血清（漿）或培養(yǎng)液中加入 1mL 提取液，10000g，常溫離心10min，取上清待測(cè)。
二、測(cè)定步驟
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將 50μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液用提取液稀釋至 0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
3、操作表
對(duì)照管
測(cè)定管
標(biāo)準(zhǔn)管
空白管
上清液（mL）
0.3
0.3
-
-
標(biāo)準(zhǔn)品（mL）
-
-
0.3
-
試劑一（mL）
0.65
0.65
0.65
0.65
試劑二（mL）
-
0.1
0.1
-
H2O（mL）
0.1
0.4
混勻，室溫放置 10min，測(cè)定 412nm 吸光值，分別記為 A 對(duì)照、A 測(cè)定、
A 標(biāo)準(zhǔn)、A 空白，計(jì)算?A 測(cè)定=A 測(cè)定-A 對(duì)照，算?A 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白。
三、計(jì)算公式
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為 x 軸，?A 標(biāo)準(zhǔn)為 y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程 y=kx+b，將?A 測(cè)定代入公式得到 x（μmol/mL）
2、 非蛋白質(zhì)巰基含量計(jì)算：
（1） 按樣本鮮重計(jì)算：
非蛋白質(zhì)巰基含量（μmol/g 鮮重）=x×V 提取÷W=x÷W
（2） 按血清、培養(yǎng)液體積計(jì)算：
非蛋白質(zhì)巰基含量（μmol/mL）=x×（V 提取+V 液體）÷V 液體=1.1×x。
（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：
非蛋白質(zhì)巰基含量（μmol/104 cell）=x×V 提取÷500=0.002×x。
V 提取：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr，樣本蛋白濃度，mg/ml；500：500 萬個(gè)細(xì)胞；V 液體：血清（漿）或培養(yǎng)液體積，0.1mL。
注意事項(xiàng)：
1、當(dāng)吸光值大于 1.2 時(shí)，建議將上清液用提取液稀釋后測(cè)定；吸光值過小時(shí)，建議提高樣品質(zhì)量或體積進(jìn)行測(cè)定。
